制備型SFC應該怎么用

制備型SFC簡介
純化的目的是去除所有會影響產(chǎn)品質(zhì)量、造成環(huán)境污染、引入摻雜物或?qū)е庐a(chǎn)品受到污染的物質(zhì)1。化學意義上的純化是指分離物質(zhì)中的各組分并去除雜質(zhì)。從古到今，為了提高生活質(zhì)量，人們運用各種方法來分離和純化化學物質(zhì)。從藥物發(fā)現(xiàn)到化工材料、天然產(chǎn)物和食品生產(chǎn)，純化都是必不可少的。總體而言，純化的目的是分離物質(zhì)、改變混合物組成或去除干擾物2。具體而言，研究人員進行純化的目的多種多樣，包括結(jié)構(gòu)解析、活性研究、產(chǎn)品配方和產(chǎn)物富集、雜質(zhì)分析等等。面對純化挑戰(zhàn)，市面上有許多復雜程度和效果各不相同的解決方案。然而，如何實現(xiàn)化合物的高通量分離通常是提升效率的瓶頸。因此，人們迫切需要更快、更高效的純化工具3。超臨界流體技術(shù)(SFx)包括一系列基于CO2的技術(shù)，專為精簡純化工作流程而設計，制備型超臨界流體色譜(Prep SFC)就是其中之一。本初學者指南將介紹Prep SFC用作純化技術(shù)的原理、應用、儀器和工作流程。

SFX技術(shù)簡介
SFC純化的基礎是超臨界流體技術(shù)(SFx)。沃特世SFx技術(shù)包括超臨界流體萃取(SFE)、分析型色譜(UPC2)和制備型色譜(Prep SFC)，它們都以亞臨界或超臨界狀態(tài)的CO2為主要溶劑。SFx技術(shù)采用CO2替代液態(tài)有機溶劑和水性溶劑，是液相純化技術(shù)的正交技術(shù)，而且更加環(huán)保和經(jīng)濟有效。之所以說SFx是一項“綠色”技術(shù)，是因為它不產(chǎn)生有機廢液，可減少環(huán)境影響。相較于LC純化，SFx在速度和選擇性方面均有顯著提升，這意味著從復雜原料到終產(chǎn)物所需的時間和成本大大降低。隨著儀器技術(shù)的發(fā)展，各種純化應用越來越明顯地體現(xiàn)出SFx技術(shù)帶來的分離能力優(yōu)勢.

以CO2為溶劑

超臨界流體是流體壓力和溫度超過臨界值的產(chǎn)物。在臨界點處，氣液兩相間的界面消失，此時高度壓縮氣體的密度與液體密度相近。超臨界流體還具有類似于氣體的高擴散性和低粘度。其溶解能力主要與密度相關(guān)，而密度可通過控制壓力和溫度進行調(diào)節(jié)。一般來說，密度越大溶解能力越強?，降低溫度或增大壓力均可增大密度。另一方面，升高溫度或減小壓力則會使密度變小?。圖1所示為CO2的相圖，展示了CO2從一種狀態(tài)到另一種狀態(tài)的物理變化及其臨界點。

 

圖1. CO2相圖；展示了CO2從一種狀態(tài)到另一種狀態(tài)的物理變化及其臨界點。

很多物質(zhì)在極端條件下才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌R界狀態(tài)，而且在該狀態(tài)下會表現(xiàn)出某些不良特性。表1所示為幾種物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槌R界流體的條件及其在此狀態(tài)下的特性。不同于其它超臨界物質(zhì)，CO2不可燃、無爆炸危險、無毒性或腐蝕性，因此通常被認為是一種十分安全的物質(zhì)3。此外，CO2的超臨界狀態(tài)（31 °C，74 bar）很容易得到，因此人們能夠在可接受的溫度和壓力范圍內(nèi)控制其密度?。不僅如此，由于臨界溫度相對溫和，它還適用于處理熱不穩(wěn)定樣品。CO2還易于通過其它工業(yè)工藝回收，因而價格相對低廉；這意味著它對環(huán)境CO2水平的影響是中性影響?。上述所有優(yōu)勢使得CO2成為了超臨界流體技術(shù)最常用的物質(zhì)。

 

表1. 幾種物質(zhì)的臨界溫度和壓力，以及這些物質(zhì)值得注意的性質(zhì)。

SFX純化工作流程
純化工作流程由多個步驟組成，其復雜性和必要性根據(jù)應用要求而異。最基本的SFx純化工作流程包括以下方面（圖2）：

 

圖2. 完整SFx工作流程的示意圖。

原料或樣品：樣品可能很復雜（例如天然的植物性樣品），也可能相對簡單（例如經(jīng)過準確表征的候選藥物），這將決定需要進行何種程度的樣品制備（如果需要）以及純化的規(guī)模。盡可能收集有關(guān)樣品和最終產(chǎn)品的信息（例如熱穩(wěn)定性、極性、溶解度和反應性）也很重要，這些信息將決定樣品的處理方式。

樣品制備：純化的第一步需要根據(jù)原料狀態(tài)和應用的目的或適用范圍正確地制備樣品。樣品制備可能包括研磨、干燥、提取和過濾等多個步驟，也可能只需溶解樣品將其制成溶液。超臨界流體萃取(SFE)是SFx工作流程的第一步（即樣品制備）。該技術(shù)通常用于涉及工業(yè)粗制品、植物性材料或天然產(chǎn)物的應用。

樣品純化：純化的作用是降低樣品復雜性，或者分離出純度達到指定范圍的終產(chǎn)物進行分析或用于產(chǎn)品配方。通過SFE制備的樣品通常是含有目標化合物和雜質(zhì)的復雜混合物。作為SFx工作流程的第二個步驟（純化），制備型超臨界流體色譜(Prep SFC)會從提取物中純化出一種或多種目標物質(zhì)。Prep SFC還可應用于多種其它方法制備的樣品，而不僅僅局限于SFE法制備的樣品。

終產(chǎn)物：獲得終產(chǎn)物是工作流程的最終目標。它可以是分析得到的數(shù)據(jù)和信息、某種工藝所需的精煉原料，或者是可直接使用的終產(chǎn)物。終產(chǎn)物決定了成功的工作流程所需的儀器和方法。在SFx工作流程中，提取(SFE)和純化(Prep SFC)之前及之后的樣品分析由超高效合相色譜(UPC2)完成。

上述SFx技術(shù)中的任何一種都可以根據(jù)需要用于非SFx工作流程中的樣品制備、純化或分析步驟。

PREP SFC簡介
制備型色譜：HPLC到SFC的沿革

過去20年來，制備型高效液相色譜(Prep HPLC)一直都是最常用的純化技術(shù)之一?。具體而言，該技術(shù)是精細化學品、制藥和生物技術(shù)行業(yè)普遍使用的一種分離工藝，被廣泛應用于產(chǎn)品純化?。在這期間，Prep HPLC已發(fā)展成為一種非常高效且適用性極廣的技術(shù)，尤其是在非手性純化領(lǐng)域。反相液相色譜(RPLC)的優(yōu)勢是采用幾乎通用的固定相(C18)，以及由水和乙腈組成的通用混合流動相。RPLC兼容質(zhì)譜(MS)分析，它與MS聯(lián)用(RPLCMS)已成為許多研究環(huán)境下的標準純化方法?。

盡管應用廣泛，Prep HPLC也存在諸多缺點。相較于處理的總樣品量，純化一定質(zhì)量合物的流動相用量相當大。典型的Prep HPLC餾分含有大量溶劑（包括有機溶劑和水性溶劑），分析人員需要花費大量時間和精力來干燥和獲取終產(chǎn)物，這極大限制了純化效率。LC所用的溶劑會污染局部環(huán)境（通過蒸發(fā)或接觸）和大氣環(huán)境（通過化學廢棄物焚燒）。正相液相色譜(NPLC)對環(huán)境的危害更大，因為其流動相通常是純有機溶劑。鑒于上述環(huán)境問題，購買和處置LC流動相溶劑的成本越來越高；因此人們迫切需要一種對溶劑依賴程度更低或更環(huán)保的純化方法?。SFC正是這樣一種替代方案，它有助于突破效率瓶頸，同時可帶來縮短用時、減少廢液和降低成本的優(yōu)勢?。最近，SFC儀器方面的進展使得該技術(shù)作為手性和非手性純化的一種有用工具再次成為人們的關(guān)注焦點?。在分析和純化領(lǐng)域，SFC是比HPLC更加環(huán)保的替代方法6,3。

SFC也是色譜！

超臨界流體色譜(SFC)是一種色譜技術(shù)，其使用亞臨界（液態(tài)）和超臨界CO2作為流動相的主要溶劑，通常還需搭配有機溶劑使用。和所有色譜技術(shù)一樣，SFC技術(shù)也基于分析物在固定相（色譜柱）和流動相（溶劑）之間的分配來分離各組分?。HPLC與SFC有許多相似之處，例如：SFC可在等度和梯度方法條件下運行，并且兼容所有標準檢測技術(shù)，如紫外(UV)檢測、光電二極管陣列(PDA)檢測、蒸發(fā)光散射(ELS)檢測和質(zhì)譜(MS)檢測。常規(guī)Prep SFC工作流程與HPLC的相同，包括方法開發(fā)、放大、餾分收集，以及對收集到的餾分進行純度分析（圖3）。SFC的回收率和樣品純度可媲美RPLC，在某些應用中SFC的回收率較高，而對于其它應用，HPLC是更好的解決方案?。

 

圖3. 制備型色譜工作流程。

SFC一般采用正相色譜分離原理。SFC與HPLC的不同之處在于，SFC采用CO2替代非極性液態(tài)組分（例如正己烷和庚烷）作為流動相的主要組分?。由于超臨界CO2是可壓縮流體，因此壓力和溫度是控制溶劑強度，進而影響色譜保留性和選擇性的重要參數(shù)7,9。超臨界CO2是色譜純化的理想之選，因為其不可燃、無毒并且具有高擴散性、低粘度和出色的溶解能力10。近年來，得益于節(jié)省溶劑和高效率的優(yōu)勢，SFC備受純化實驗室青睞。

PREP SFC的優(yōu)勢：節(jié)省溶劑
由于采用CO2替代了大部分流動相，Prep SFC關(guān)鍵優(yōu)勢是溶劑用量少?。這一優(yōu)勢在分析型分離中也許并不明顯，但在制備型分離中效果相當顯著。許多純化實驗室都需要花費相當多的時間從餾分中去除溶劑，這極大制約了化合物純化完成后獲得目標產(chǎn)物或結(jié)果的效率。若采用Prep SFC，流動相中的CO2通過降壓即可除去，只剩下少量助溶劑。所得餾分中的產(chǎn)物濃度也更高，縮短了去除溶劑和產(chǎn)物分離所需的時間?。餾分還可以直接進行分析，無需樣品富集或濃縮。對于那些在普通長時間干燥條件下會發(fā)生降解的化合物而言，這一點至關(guān)重要3。

SFC有機溶劑用量較低帶來的其它優(yōu)勢還包括節(jié)約成本、更安全（就可燃性和毒性角度而言），以及對環(huán)境影響更小等等。在溶劑購買和處置方面，SFC的成本優(yōu)勢相當可觀；除此之外，由于去除溶劑所需的能耗更低，還能進一步節(jié)省成本?。SFC還可避免使用有毒溶劑，例如RPLC使用的乙腈以及NPLC使用的脂肪烴和氯化物溶劑。作為其它工業(yè)工藝的副產(chǎn)物，CO2價格相對低廉，而且可以循環(huán)使用。

PREP SFC的優(yōu)勢：提高效率
SFC效率的提升得益于流動相的低粘度和高擴散性對色譜分析速度和效率的提升3。圖4比較了HPLC、UPLC、SFC和UPC2的Van Deemter曲線。在色譜分析中，分離速度部分取決于溶質(zhì)在流動相中的擴散速度11及其進出固定相的速度。SFC的Van Deemter曲線比HPLC更寬更平，這表示SFC在流速（線性流速）增大的情況下仍能保持較高的色譜效率（低塔板高度）。SFC的高擴散系數(shù)直接轉(zhuǎn)化成了更快的色譜分析速度11。

 

圖4. HPLC、SFC、UPLC和UPC2的Van Deemter曲線。

由于流動相粘度較低，色譜柱和系統(tǒng)壓力也較低，因此可采用高達HPLC流速3~4倍的線性流速以及粒徑更小的色譜柱6,7。此外，低粘度還能縮短平衡時間。這樣一來，運行時間縮短，分離效率提高，進而可增大載樣量并縮短進樣周期；這些對于任何制備型色譜分離而言都是提高效率的關(guān)鍵參數(shù)。因此，SFC得以在更短的時間內(nèi)獲得純化合物，從而提高總體工作效率6,7。表2給出了SFC相較于HPLC在時間和工作效率方面實現(xiàn)提升的示例3。

表2. 制備型SFC與制備型HPLC對比（示例數(shù)據(jù)由默克公司(Merck & Co.)提供）3。

PREP SFC是反相液相色譜RPLC的正交技術(shù)

利用SFC與RPLC的正交關(guān)系可提高多種應用的產(chǎn)物質(zhì)量。采用C18色譜柱的RPLC是一種幾乎通用的解決方案，能夠極大簡化方法開發(fā)過程，但由于其使用水性流動相，溶劑兼容性和化合物溶解性非常有限。另一方面，SFC可配合多種有機稀釋劑使用，對溶劑和化合物的兼容范圍更廣。此外，SFC可選用的固定相也非常豐富。

之所以說SFC是RPLC的正交檢測技術(shù)，是因為SFC一般被視為正相色譜，并且可提供多種易于操作的色譜分離選項。由于兼具正相選擇性和高分離效率，SFC在立體異構(gòu)體、位置異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)相似化合物分離方面的優(yōu)勢尤其明顯?。對于非極性化合物，SFC的靈活性允許分析人員采用反相色譜柱（例如C18），同時以水作為添加劑，將應用擴大到極性更強的范圍10。對于化合物易降解的應用，SFC純化更是理想的替代解決方案，因為SFC方法分離速度快、不使用水，并且餾分干燥步驟能在低溫條件下快速完成。

rep SFC的回收率和純度可媲美RPLC，某些應用采用SFC和RPLC均可。一項研究篩查了SFC和LC純化對某制藥化合物數(shù)據(jù)庫中化合物的適用性，所得結(jié)果如圖5所示。約82%的化合物采用兩種純化技術(shù)均可純化12。但除此之外，該研究還證明了這兩種純化平臺的互補性。部分化合物只能通過SFC法純化(4%)，還有一部分化合物只能通過LC法純化(8%)。兩種純化平臺聯(lián)用所帶來的靈活性為優(yōu)化分離和純化方案提供了更多可能性。SFC的選擇性與RPLC互補，因此我們可在方法開發(fā)過程中引入正交技術(shù)用于分離復雜的棘手樣品?。采用跨平臺多步純化方案或使用正交技術(shù)進行餾分分析，可獲取純度更高的產(chǎn)物和更豐富的信息。圖6所示為采用正交的LC和SFC分離方法純化某復雜基質(zhì)中所含化合物的示例。

 

圖5. 使用SFC和LC方法篩查化合物純化成功率所得的餅圖12。

 

圖6. 采用兩步正交純化法（LC為第一步，SFC為第二步）純化某天然產(chǎn)物提取物中目標化合物的示例。